shkolaput.ru 1

АКАДЕМИЯ НАУК СССР 

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ 
На правах рукописи 
СМИРНОВ Олег Ювенальевич 
УДК 577.21 
СОЗДАНИЕ ДОМИНАНТНЫХ МАРКЁРОВ ДЛЯ РАСТЕНИЙ 
0 3 . 0 0 . 0 3 - Молекулярная биология 
А в т о р е ф е р а т 
диссертации на соискание ученой степени 
кандидата биологических наук 
Москва - 1988 







Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии рас­
тений Института молекулярной биологии АН СССР. 
Научные руководители: доктор биологических наук, профессор 
К.Г.Скрябин, кандидат биологических наук В.М.Захарьев. 
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Я.И.Бурьянов, 
доктор биологических наук В.И.Негрук. 
Ведущая организация: Институт молекулярной генетики АН СССР. 
Защита диссертации состоится 
1988 г. 
часов на заседании Специализированного Учёного совета 
в 
Д.002.79.01 по защите диссертаций на соискание учёной степени 
доктора наук при Институте молекулярной биологии АН СССР 
по адресу: 117984, Москва, ул.Вавилова, Д.32. 
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМБ АН СССР. 
Автореферат разослан 
1988 года. 
Учёный секретарь 
Специализированного совета, 
кандидат химических наук 
А.М.Крицын 

— 1 — 
Актуальность темы. Молекулярная биология растений открыла 
новый путь конструирования генов с желаемыми характеристиками 
и введения их в растения, что может быть эффективнее традици­
онных методов селекции. Разработанные в последнее время методы 

переноса генов в высшие растения дали исследователю мощный ин­

струмент для выяснения закономерностей, лежащих в основе таких 
фундаментальных процессов передачи генетической информации, 
как транскрипция и трансляция. 
В отличие от прокариот, у высших эукариот, особенно у рас­
тений, процессы транскрипции и трансляции на молекулярном уров­
не остаются во многом неисследованными. Несмотря на имеющиеся 
данные о регуляторных элементах промоторов и важной роли в 
трансляции нуклеотидов, окружающих стартовый AUG-кодон мРНК, 
всё ещё нет четкого представления о структурной организации 
5'-нетранслируемой последовательности мРНК и ее функции при 
инициации трансляции. 
Изучение механизмов, контролирующих работу генов, позво­
лит создавать эффективные системы экспрессии гетерологичных 
генов, кодирующих определенные целевые белки. 
Цель и задачи работы. Цель работы - конструирование генно-
инженерными методами доминантных маркёров растений, содержащих 
различные нуклеотидные последовательности в области инициации 
трансляции. В соответствии с этим были поставлены следующие 
задачи: клонировать регуляторные участки - промотор и термина­
тор - гена нопалинсинтетазы из Т-ДНК Ti-плазмиды Agrobacterium 
tumefaciens, который конститутивно работает в растениях; по­
лучить набор делеций в районе ATG-кодона; создать векторные мо­
лекулы, позволяющие экспрессировать чужеродные гены в растени-


— 2 — 
ях; сконструировать доминантные маркеры для растений (гены 
устойчивости к канамицину) с разной первичной структурой в 
районе ATG-кодона. 
В качестве компонентов маркерных генов были выбраны про­
мотор хорошо изученного гена нопалинсинтетазы, а также ген 

неомицинфосфотрансферазы из Tn5, экспрессию которого можно 

легко определить как in vivo, по устойчивости клеток к кана­
мицину, так и in vitro, по активности фермента в клеточном 
экстракте. 
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые 
получен набор гибридных маркерных генов nos-neo для растений, 
у которых расстояние от инициирующего AUG-кодона до кэп-
сайта мРНК составляет от 17 до 71 нуклеотида. Ряд генов 
nos-neo содержит дополнительный "ложный" (то есть не по­
падающий в рамку считывания) AUG-триплет в 5'-нетранслируе-
мой последовательности, находящийся на том же расстоянии от 
5'-конца мРНК, что и инициирующий AUG-кодон в других конструк­
циях. 
На основании результатов функционального анализа получен­
ных гибридных генов доказано, что в кишечной палочке работает 
не промотор гена нопалинсинтетазы, как предполагалось ранее 
(Herrera-Estrella L. et al., 1983), а другой промотор, располо­
женный в 5'-концевом участке гибридного гена. Уровень экспрессии 
генов nos-neo в агробактерии отличается от уровня их экспрессии 
в E.coli, что подтверждает имеющиеся данные о различии систем 
транскрипции и трансляции у E.coli и агробактерии. 
Практическая ценность работы заключается в том, что полу­
ченные векторные молекулы ДНК, содержащие различные варианты 
nos-промотора и nos-терминатора могут служить основой при 


— 3 — 
конструировании гибридных генов, конститутивно работающих в 
растениях. Кроме того, анализ экспрессии в растительных клет­
ках полученных гибридных маркерных генов позволит оценить вли­

яние на экспрессию структуры мРНК а районе AUG-кодона и вы­

брать конструкцию, обеспечивающую максимальные уровень экс­
прессии. 
Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора ли­
тературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, вы­
водов. Материал изложен на 80 страницах машинописного текста, 
включает 16 рисунков и 2 таблицы. Список использованной лите­
ратуры содержит 115 наименований. 
Апробация. Материалы диссертации докладывались на заседа­
ниях отдела генетической инженерии и на конкурсе научных ра­
бот молодых ученых института молекулярной биологии; материа­
лы были представлены на I Международном конгрессе по молеку­
лярной биологии растений, Саванна, США, 1985; на тематической 
выставке "Биотехнология - народному хозяйству" на ВДНХ 
СССР, Москва, 1985; на V Всесоюзном биохимическом съезде, 
Киев, 1986; на международном симпозиуме по генетической ин­
женерии растений, Пущино, 1987. 
Материалы и методы. 
В работе использованы штаммы Escherichia coli К802 и 
F–Z–ΔM15recA; Agrobacterium tumefaciens С58 и GV3850. 
Среды. Для E. coli применяли среды YT или DYT, для 
агробактерии - среду РА (4 г/л пептона, 2 MM сульфата маг­
ния, pH 7,2); вое культуры выращивали на чашках со средой YT, 


- 4 -
содержащей 1,5% агара. 
Выделение плазмидных ДНК. Выделение плазмид из E.coli 
проводили щелочным методом. Плазмиды ив агробактерии выделяли 
по методу, разработанному в Гентском университете: после ин­
кубирования в течение 24–48 часов при 28°С клетки лизировали 
с помощью проназы и гидроксида натрия. Доводили pH до 8,5 
раствором трис-HCl pH 7,0, добавляли хлорид натрия до 1M, 

осаждали. Затем осаждали ДНК с помощью ПЭГ 6000 и проводили 

ультрацентрифугирование в градиенте хлористого цезия. 
Молекулярное клонирование, идентификацию рекомбинантных 
клонов методом гибридизации in situ бактериальных колоний, 
быстрое разрушение колоний E.coli для определения наличия 
вставок в плазмидах проводили по Маниатису Т. и др. (1984). 
Обработку ДНК нуклеазой Bal31 проводили в буфере, со­
держащем 6 MM трис-HCl pH 8,1, 600 MM NaCl, 12 MM CaCl2, 
12 MM MgCl2 при 30°С. Реакцию останавливали, добавляя ЭДТА 
до концентрации 50 MM, 20 мкг тРНК и помещая пробирку в лед. 
Нуклеотидную последовательность ДНК определяли по методу 
Максама–Гилберта (1977, 1980). 
Конъюгационный перенос плазмид из E.coli в агробактерию 
проводили по методу Van Haute Е. et al. (1983). 
Активность неомицинфосфотрансферазы в клеточных экстрак­
тах определяли по методу An G. et al. (1985). 
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 
1. Клонирование регуляторных участков гена нопалинсинтета­
зы. 
Поскольку ген нопалинсинтетазы из Т-ДНК Ti-плазмиды аг­
робактерии является конститутивным (он экспрессируется во всех 


- 5 -
тканях растения), его регуляторные участки - промотор и 
терминатор - весьма удобны для создания маркерных генов рас­
тений. 
На основе известной рестрикционной карты плазмиды pTiC58 
и локализации гена нопалинсинтетазы (Depicker A. et al., 1980, 
1982) нами был получен клон, содержащий полный структурный 
ген в HindIII-фрагменте размером 3,3 тысячи пар нуклеотидов. 
По данным нуклеотидной последовательности гена нопалин­

синтетазы (Depicker A. et al., 1982), его промотор находится 

в Sau3AI-фрагменте размером 345 пар нуклеотидов, а терми­
натор (участки полиаденилирования и терминации транскрипции) 
- во фрагменте размером 249 пар нуклеотидов. 
SauЗАI-фрагмент ДНК, содержащий nos-промотор, клониро­
вали в BamHI-сайт вектора pUC19,a его ориентацию определяли 
путем секвенирования ДНК. Полученная плазмида была обозначе­
на pOS7 (рис.1). Поскольку клонированный фрагмент содержал, 
кроме промотора, первые 16 кодонов гена нопалинсинтетазы, что­
бы удалить структурную часть гена и получить набор делеций в 
нетранслируемой 5'-последовательности, плазмиду pOS7 расщеп­
ляли рестриктазой EcoRI, обрабатывали нуклеазой Bal31, репа­
рировали концы с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I 
и лигировали с BamHI-линкером. После расщепления рестриктазами 
BamHI и HindIII И фрагменты ДНК соответствующего размера элюиро­
вали из 5% ПААГ и лигировали с вектором pUC19, расщепленным 
этими рестриктазами. Затем определяли нуклеотидную последова­

тельность полученных делеционных вариантов nos-промотора со 
стороны EcoRI-сайта (рис.1). 
В работе использовали два терминатор-содержащих фрагмента. 
Первый - ВаmHI-HindIII-фрагыент размером 1,1 тысячи пар нуклео­
тидов, содержащий 3'-конец гена нопалинсинтетазы (плазмида 




- 6 -
Рис.1 Конструирование плазмид, содержащих делеции в 5'-конце­
вой части гена нопалинсинтетазы. а - схема получения 
делеций в плазмиде pOS7, содержащей промотор и первые 

16 кодонов гена nos.  P n o s - промотор гена nos, стрелкой 

указана его ориентация; б - делеции в 5'-районе гена 
nos. Транскрибируемая последовательность изображена за­
главными буквами, транслируемые кодоны - вразрядку. 

Стрелками обозначены левые границы делеций, цифрами -
номера плазмид pOS, содержащих такой "укороченный" про­
мотор. Ниже в скобках даны номера плазмид, содержащих 
соответствующий промотор и терминатор гена nos
. Звез­
дочками выделены нуклеотиды, необходимые для инициации 
транскрипции и трансляции. 


-  7 -
pOS6); второй - Sau3AI-фрагмент размером 249 п.н., клони­
рованный в векторе pUR222, а затем в pUC19 с целью создания 
BamHI-сайта перед участком терминации транскрипции (плазмида 
POS28). 
В плазмиды, несущие различные варианты 5'-концевой облас­
ти гена нопалинсинтетазы, клонировали по BamHI-EcoRI-сайтам 
фрагменты ДНК, содержащие терминатор этого гена (рис.2). Плаз­
миды pOS25 и pOS26 имеют в своем составе "большой" термина­
тор-содержащий фрагмент, а остальные - "малый". 
Полученные векторы экспрессии в растениях (pOS25, pOS26, 
pOS29, pOS30, pOS32, pOS34 и pOS35) имеют структуру "промо-
тор-BamHI-терминатор", что позволяет путем клонирования в 
BamHI-сайт помещать под контроль этих регуляторных участков 
различные структурные гены. 
Ген, клонированный в плазмидах pOS26 и pOS35, будет нахо­
диться под полным контролем nos-промотора, а его трансляция 
будет начинаться с AUG-кодона гена nos; остальные плазмиды 
обеспечивают лишь транскрипционный контроль экспрессии клони­
рованных генов, что позволяет проверять эффективность раз­

личных участков инициации трансляции структурных генов. 

2. Получение гибридных генов nos-neo
В качестве маркерного гена был использован ген неомицин­
фосфотрансферазы neo из Tn5 с известной нуклеотидной после­
довательностью; ген был клонирован в pBR322 в лаборатории ге­
нетической инженерии растений А.Ш.Ташпулатовым, - плазмида 
pAT1. Структурная часть гена neo (около 800 п.н.) находится 
в BglII-SmaI-фрагменте, причем BglII-сайт расположен в 5'-
нетранслируемой последовательности. А.Ш.Ташпулатовым был 



- 8 -
Рис.2 Схема получения векторов экспрессии, содержащих промо­
тор и терминатор гена нопалинсинтетазы. Сайты рестрик­
таз обозначены следующим образом: B, BamHI; E, EcoRI; 
H, HindIII; S, SalI. Рnos, Tnos - промотор и термина­
тор гена nos, стрелкой указана их ориентация. 

- 9 -
удален промотор гена neo вместе с участком Шайна-Дальгарно 
(плазмида pAT4), либо вместе с первыми пятью кодонами (плаз­
мида pAT2), вместо которых был присоединен BamHI-линкер. 
С целью уменьшения размера маркерного гена из незначащей 
3'-концевой области был удален фрагмент величиной около 550 
пар нуклеотидов. Полученная плазмида pAT4d и плазмиды pAT1 
и pAT2 были использованы для получения гибридных генов nos-
neo. 
В BamHI-сайт плазмиды pOS26 клонировали BamHI-фрагмент 
плазмиды рАТ2, в BamHI-сайты плазмид pOS25, 29, 30, 32, 34 
- BglII-BamHI-фрагмент плазмиды pAT1, а в BamHI-сайты плаз­

мид pOS25, 30 и 32 - BamHI-фрагмент плазмиды pAT4d, так 

чтобы трансляция гена неомицинфосфотрансферазы начиналась с 
AUG-кодона гена nos (в случае плазмиды pOS26) или с его 
собственного AUG-кодона (рис.3). Плазмиды, в которые был кло­
нирован BglII-BamHI-фрагмент pAT1, обозначили pOS...Neo; плаз­
миду pOS26, содержащую ген neo, также обозначили pOS26Neo; а 
плазмиды, в которые был клонирован BamHI-фрагмент pAT4d, обо­
значили pOS...Neod. Ориентацию клонированных BamHI-фрагментов 
определяли с помощью рестрикционного анализа. 
Первичную структуру промоторных районов полученных девяти 
плазмид, несущих гибридные гены nos-neo, определяли по методу 
Максама-Гилберта от сайта рестриктазы DdeI, расположенного 
перед CAAT-блоком гена nos на расстоянии 80 нуклеотидов от 
стартовой точки транскрипции. 
На рис.4 приведены нуклеотидные последовательности мест 
соединения промоторов гена nos и структурных областей гена 
neo в полученных гибридных генах nos-neo. Три из девяти по­
лученных нами конструкций по структуре 5'-района гена анало-



- 10 -
Рис.3 Схема получения гибридных генов nos-neo
Сайты рестриктаз обозначены следующим образом: B, 
BamHI; Bg, BglII; E, EcoRI. Pnos,  T n o s - промотор 
и терминатор гена nos. Стрелками указаны ориентации 
структурных элементов гибридных генов. Расположение гена 
neo обозначено штриховкой. 



 ..
T

­

х 

х 
ы 
 AT

ь 
G

 ..
G

 ..
 TT
G



 AT
C


T
 AT
 кодон
 последо
C

е
ы
 AT
 ..
 плазмида
 плазмида
 ..
 ..
C
A
G
A
 TC
T

 ..
 в
A
 в
а
 дан
 GA
а
м
 TT
 GA
T
A
 AC
T
A
 GA

T
 AT
 структуры)
 GG
 AT
 GC
G
й
G
 ..
 AT
A
G
C

 Последовательност
 шрифто
 AT
G
.
 транслируемы
м
 CG
 TC
C
 ATG-кодон
 ATG-кодон
;
С
 GA
 AT
 ..
A
 AT
е
е
T
C
A
c
 АТ
 TT
G
 AT
 GA
C
 Мелки
 первично
G
T
.
я
 район
 район
 данным)
 CG
 AC
м
С
 AT
 AT

T
 в
 в
C

G
 АТ
 ..
 AT
 подчеркнута

A

 ..
A
,
A
 AT
C

 GC
 GA
 GCA
G
 GA
T
G
 nos-neo
 ATG-кодоны
 определени
T
 nos-neo
в
в
"
о
 Bal31
 AT
 AT
 AT
 литературны
й
A
 AT
G
A
о
G

 гено
 AT
 гено
а
 (п
 AT
C
х
7
 прямог
C
 ..
 "ложный
з
A

 ..
 нуклеазо
 и
 GA
T
и
й
 (бе
T
в
 GG
 структур
 pMON17
 AT
A
 гибридны
G
и
 -
 и
9

 GC
 опыто
 AT
 б
м
C
;
 обработк
е

 инициирующи
ы

 схе
 pMON12
з
,
 посл
 и
я
е
 cgg atc cgg
C

 pOS...Neod
 Bin19
,

 GC
 последовательност
 и
 Подчеркнут
C
е
o
.
 выведенны
 TC
,
T
 сохранившаяс
 AT
 pLGV23Neo
T
,
 pOS...Ne
CC
 нуклеотидны
й
 nos,
а
 вразрядку
ы

 -
сери

pGA471

ген
дан
вательности
 TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATCTGC
1

 a
4

а/ 
pOS26Neo...TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATCTGC
pOS25Neo...TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATCTGCCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCG
p0325Neod..TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATCTGCCGGATCCGGCG
pOS32Neo...TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCG
pOS32Neod..TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCCGGATCCGGCG
pOS30Neo...TCCAATTAGAGTCCCGGATCTCATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCG
pOS30Neod..TCCAATTAGAGTCCCGGATCCGGCG
pOS29Neo...TCCCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCG
б/ 
pGA47
pMON129....TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATCTGCAGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCG
pLGV23Neo..TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATCTGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCG
pMON177....TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATCTGCAGATCCTAGACGATCGTTTCG
Bin19......TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATctgcaggatctgggatcgtttcg
Рис.


- 12 -
гичны маркерным генам, описанным в литературе. Имеются также 
некоторые отличия в терминатор-содержащем фрагменте и в раз­
мере фрагмента, содержащего структурную часть гена neo, что 
обусловлено различными схемами клонирования. 
В плазмиде pOS26Neo, как и в pGA471, единственным иниции­
рующим кодоном является ATG гена nos, однако pOS26Neo содер­
жит не 14, а 3 кодона гена nos, после которых через BamHI-лин-
кер следует не 9-й, а 6-й кодон гена neo. В остальных кон­
струкциях инициирующим кодоном является ATG гена neo. В ря­

де конструкций, как и в исходном бактериальном гене neo, перед 

инициирующим кодоном имеется дополнительный ATG-триплет, не 
попадающий в рамку считывания. Этот "ложный" триплет может 
индуцировать синтез пептида из семи аминокислот, затрудняя 
тем самым правильную инициацию трансляции. В плазмидах 
pOS25Neod, pOS30Neod и pOS32Neod этот ATG-триплет удален. 
Судя по литературным данным, удаление этого триплета ведет к 
увеличению экспрессии гена (Rogers S.G. et al., 1985). 
Интересно отметить, что "ложный" AUG-триплет мРНК должен 
быть в силу фланкирующих нуклеотидов (ACAGGAUGA) более пред­
почтителен, чем инициирующий кодон (UUCGGAUGA), при сравнении 
с предложенной консенсусной последовательностью CCA/GCGAUGG 
(Kozak M., 1984). И действительно, как показано в ряде работ, 
вектор Bin19 (Bevan M., 1984), по сравнению с pLGV23Neo (De-
shayes A. et al., 1985), повывает устойчивость клеток табака 
к канамицину лишь в 2,5 раза, в то время как вектор pGA471 
(An G. et al., 1985), где трансляция начинается с более "удоб­
ного" AUG-кодона гена nos (CUGGAAUGG), - еще в 1,5 раза (к 
сожалению, в этом случае максимальная критическая концентрация 
антибиотика не определялась). Однако ген nos-neo плазмиды 


- 13 -
PMON177, аналогичный Bin19, экспрессируется в клетках петунии 
в 5-6 раз сильнее, чем ген pMON129, аналогичный pLGV23Neo 
(Rogers S.G. et al., 1985). Такое различие в результатах 
трудно объяснить; по-видимому, оно всё же не связано с тем, 
что использован другой растительный объект. Следует указать, 
что в описанных векторах разница в расстоянии от AUG-кодона 

до 5'-конца мРНК составляла от 12 до 35 нуклеотидов (рис.4,б), 

что может, если исходить из модифицированной "сканирующей 
модели" инициации трансляции (Kozak M., 1981), влиять на 
эффективность трансляции. 
Полученные в настоящей работе плазмиды дадут возможность 
оценить in vivo эффект как расстояния от AUG-кодона до 5'-кон­
ца мРНК (pOS29Neo-pOS30Neo-pOS32Neo-pOS25Neo; pOS30Neod-
pOS32Neod-pOS25Neod), так и нуклеотидного окружения AUG-кодо­
на (pOS26Neo-pOS32Neod), а также влияние дополнительного лож­
ного AUG-триплета (pOS26Neo-pOS30Neo-pOS32Neod-pOS29Neo) при 
условии равноудаленности AUG-кодона от 5'-конца мРНК. Интерес­
ными в этом отношении могут быть опыты по электропорации 
протопластов препаратами плазмидных ДНК с измерением транзит­
ной экспрессии. 
3. Перенос гибридных генов в агробактериальный вектор pGV3850. 
Полученные маркерные гены были перенесены в рекомбинантный 
вектор PGV3850 (Zambryski P. et al., 1983), способный осуществ­
лять перенос Т-ДНК в растительный геном, методом конъюгации 
с использованием плазмид-помощников. Так как плазмиды на ос­
нове ColE1-репликона не способны реплицироваться в агробакте­
рии, то при соответствующей селекции будут отбираться только 
те клетки, в которых произошла интеграция перенесенной плазми-


-  1 4 -
ды в pGV3850. 
Частота переноса маркерных генов составляла около  1 0 - 9 , 
или почти в 50 раз ниже, чем частота переноса контрольной 
плазмиды pAT1. Это объясняется тем, что pAT1 получена на ос­
нове pBR322 и имеет bom-участок, играющий важную роль в конъ­
югационном переносе, а маркерные гены были клонированы в век­

торе pUC19, в котором bom-участок инактивирован. Однако это 

не представляет трудностей при отборе клеток агробактерий, 
содержащих коинтеграты pGV3850 и полученных нами плазмид. 
Отбор коинтегратов проводили на среде, содержащей рифам­
пицин, к которому устойчива агробактерия, и 20 мг/л канами­
цина. Клетки агробактерии, несущие различные маркерные гены 
или контрольную плазмиду pAT1 в составе рGV3850, были одина­
ково устойчивы к 200 мг/л канамицина, но на концентрации 500 
мг/л их рост немного снижался. Это согласуется с данными о 
том, что в агробактерии в малом количестве обнаруживается 
транскрипт гена nos (Janssens A. et al., 1984). 
Полученные штаммы агробактерии могут быть использованы 
для заражения листовых пластинок (дисков) или протопластов 
растений с целью получения трансформированных растений. 
4. Экспрессия генов nos-neo в E.coli
Эукариотический промотор в принципе не должен работать в 
бактериях. Однако в связи с высказанным предположением, что 
nos-промотор работает в E.coli (Herrera-Estrella L. et al., 
1983), нами была проверена экспрессия полученных конструкций 
в клетках E.coli. При этом мы считали, что уровень устойчивос­
ти клеток к канамицину в определенном диапазоне концентраций 
антибиотика пропорционален активности фермента в клеточном 
экстракте, что было подтверждено экспериментально. Сравнивая 


- 15 -
уровни устойчивости к канамицину клеток, трансформированных 
разными конструкциями генов, можно сделать вывод и об уров­
нях транскрипции и трансляции генов (конечно, это будут ка­
чественные оценки). 

Устойчивость клеток к канамицину определяли путем высева 

ночных культур в разведении 1:100, по одной капле (около 104 
клеток) на чашки с разными концентрациями антибиотика и от­
мечая наличие или отсутствие роста. 
Как оказалось, клетки E.coli, несущие маркерные гены, про­
являли разную степень устойчивости к канамицину (табл.1). 
Таблица 1 
Устойчивость к канамицину клеток E.coli, 
несущих маркерные гены nos-neo 
Структура гена в районе ATG-кодона  концентрация 
канамицина, 
Плазмида 
количество делетиро­
последова­
мг/л 
ванных нуклеотидов в  тельность 
позво­
подав­
nos-промоторе, по 
Шайна-Даль- ляющая  ляющая 
сравнению с плазми­
гарно 
клеткам  рост 
дой pOS26 
расти  клеток 
-
-
-
-

pOS26Neo 

нет 
-

pOS25Neod 
10 
нет 


pOS32Neod 
26 
нет 


pOS30Neod 
39 
нет 

10 
pOS25Neo 
10 
10 
25 
pOS34Neo 
есть 
pLGV23Neo 
10 
есть 
10 
25 
pOS32Neo 
26 
есть 
75 
100 
pOS30Neo 
39 
есть 
100-150 
200 
pOS29Neo 
50 
есть 
50 
75 
pAT1 
-
есть 
500 


- 16 -

Если ген содержал последовательность Шайна-Дальгарно, то ус­

тойчивость клеток в целой была выше; для обоих типов плазмид 
(Neo и Neod) при увеличении размера делеции в nos-промото­
ре, то есть при "перемещении" ATG-кодона к точке инициации 
транскрипции, устойчивость клеток к канамицину возрастала, за 
исключением плазмиды pOS29Neo. Устойчивость E.coli, несущей 
pLGV23Neo, соответствовала литературным данным (Herrera-Estrella 
L. et аl., 1983). Плазмида pOS26Neo не придавала клеткам E.coli 
устойчивости, что противоречит данным (An G. et al., 1985), 
согласно которым вектор pGA471 (рис.4,б) придает E.coli ус­
тойчивость к 10 мг/л канамицина. 
Причина разной степени устойчивости клеток E.coli, несу­
щих маркерные гены, к канамицину, возможно, заключается в 
том, что при создании генов nos-neo в месте соединения про­
мотора nos и гена neo возникает бактериальный промотор, у 
которого роль блока Прибнова может играть последовательность 
TCTGAT, находящаяся в 5'-нетранслируемой области гена neo, 
и если в подсоединяемом nos-промоторе будет содержаться бо­
лее-менее функциональный -35-й район гомологии, то образуется 
"искусственный" промотор. 
Полученные данные по устойчивости к канамицину клеток 
E.coli, несущих плазмиды pOS26Neo, pOS25Neo, pOS32Neo и 
pOS30Neo, доказывают, что в кишечной палочке функционирует 
не nos-промотор, как предполагалось ранее, а другой бактери­
альный промотор, возникавший при конструировании гибридных 
генов. Как отмечалось, клетки агробактерии, несущие маркерные 

гены, устойчивы к высоким концентрациям канамицина в одинако­

вой степени. Это указывает на то, что сигналы регуляции экс­
прессии генов у E.coli и агробактерии, как отмечалось в обзо-


- 17 -
ре Пирузян Э.С. и Андрианова В.М. (1985), различаются. 
ВЫВОДЫ 
1. Клонированы регуляторные участки (промотор, термина­
тор) гена нопалинсинтетазы, работающего в растениях; получен 
набор делеций в районе ATG-кодона гена. 
2. Созданы векторные молекулы, содержащие "кассеты экс­
прессии", обеспечивающие работу в растениях генов, клониро­
ванных в BamHI-сайт. 
3. Сконструированы гибридные маркерные гены nos-neo для 
растений, содержащие различные нуклеотидные последовательнос­
ти в области инициации трансляции. Анализ работы этих конст­
рукций в растительных клетках даст возможность оценить влияние 
структуры мРНК в районе AUG-кодона на экспрессию гена. 
4. Полученные маркерные гены с разной эффективностью экс­
прессируются в E.coli; разница в их экспрессии в агробактерии 
не обнаружена. Сделан вывод о различии системы регуляции экс­
прессии у E.coli и агробактерии. 
5. Маркерные гены перенесены в агробактерию и включены в 
состав рекомбинантного вектора pGV3850. Они могут быть использо­
ваны для заражения листовых пластинок (дисков) или протоплас­
тов. 
Список работ, опубликованных по теме диссертации 
1. Zakharyev V.M., Muradov A.Z., Smirnov O.Yu., Tashpulatov 
A.S., Skryabin K.G., Bayev A.A. Construction of the 
intermediate vectors for expression in higher plants. -
Abstracts of the first international congress of plant 
molecular biology, The University of Georgia, USA, 1985, 
p.114. 


— 18 — 

2. Захарьев В.М., Мурадов А.З., Смирнов О.Ю., Ташпулатов А.Ш., 
Федорова О.Е., Скрябин К.Г., Баев А.А. Создание промежуточ­
ных векторов экспрессии для растений. У Всесоюзный биохи­
мический съезд. Тезисы стендовых сообщений, М.: Наука, 
1986, Т.2, с.430. 
3. Смирнов О.Ю., Ташпулатов А.Ш., Захарьев В.М., Скрябин К.Г. 
Конструирование гибридов NOS-NPT - маркерных генов рас­
тений. - Биоорганическая химия, 1987, 13, №8, с.1142-1145. 





В печать 9.02.88 г. Формат 60х84/16 
Печ. л. 1,25. Усл.-печ. л. 1,16. Уч.-изд. л. 0,7. Тир. 100. 
Изд. № 106