shkolaput.ru 1 2 3


На правах рукописи


ПОНОМАРЁВ СЕРГЕЙ АЛЕКСЕЕВИЧ


ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ФАКТОРОВ ЕСТЕСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ, СВЯЗАННЫХ С КОСМИЧЕСКИМ ПОЛЕТОМ


14.03.08 – авиационная, космическая и морская медицина


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук


Москва-2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации-Институте медико-биологических проблем РАН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, Моруков Борис Владимирович


Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ильин Вячеслав Константинович

доктор медицинских наук Белопольский Александр Александрович


Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение “Научно-исследовательский испытательный центр подготовки космонавтов имени Ю.А. Гагарина”


Защита диссертации состоится 17 ноября 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации-Институте медико-биологических проблем РАН по адресу 123007, Москва, Хорошевское шоссе, д. 76-а.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ-ИМБП РАН.


Автореферат разослан 13 октября 2011 г.


Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук М.А. Левинских


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

За последние четыре десятилетия накоплен большой фактический материал о состоянии адаптивного иммунитета человека при воздействии на организм неблагоприятных факторов космического полета, таких как микрогравитация, космическое излучение, нервно-эмоциональное напряжение, изоляция в герметичном помещении ограниченного объема и др. Исследования иммунного статуса космонавтов и астронавтов, совершивших космические полеты различной продолжительности на космических кораблях типа Салют, Аполлон, Союз и Спейс Шаттл и на орбитальных станциях Скайлэб, Салют-6, 7, Мир и МКС позволили установить в раннем послеполетном периоде ряд негативных сдвигов, включающих изменения количественного содержания и функциональной активности Т- и В-лимфоцитов [Константинова И.В.,1988; Crucian B.E. et al., 2008; Morukov B. et al., 2011]. Однако очевидные успехи в изучении адаптивного иммунитета космонавтов, а также добровольцев, участвовавших в экспериментах, моделирующих воздействие на организм условий пребывания на борту орбитальных космических станций, практически исключили из интересов космической иммунологии исследования важнейших клеточных факторов естественной резистентности - моноцитов и нейтрофилов.


В последние десятилетия были получены новые экспериментальные данные, убедительно продемонстрировавшие ключевую роль врожденной иммунной системы как в борьбе с патогенными микроорганизмами, так и в активации и регуляции системы приобретенного иммунитета [Ковальчук Л.В. и др., 2005; Лебедев К.А. и др., 2009; Medzhitov R. et al., 1997; Iwasaki A. et al., 2004]. Возрождение концепции естественного иммунитета на качественно новом уровне было связано, в первую очередь, с открытием паттерн-распознающих рецепторов (pattern-recognition receptors, PRR), которые узнают стереотипные и консервативные в эволюции молекулы микроорганизмов, присущие одновременно большим систематическим группам микробов (pathogen-associated molecular patterns, PAMP) [Janeway C.A., 1989]. Сложность и разнообразие строения этих рецепторов позволяют им распознавать не только самые различные экзогенные лиганды – липополисахарид (ЛПС) бактерий, маннонов грибов, нуклеиновых кислот вирусов, но и эндогенные лиганды, появляющиеся в результате развития воспаления и (или) повреждения тканей, такие как белки теплового шока Wendling U. et al., 2000.

По своей функции PRR разделяются на три клас­са: секреторные PRR, играющие роль опсонинов, эндоцитозные PRR, опосредующие немедленный фагоцитоз, и сигнальные PRR, опосредующие активацию клеток врожденной системы [Хаитов Р.М. и др., 2009]. При взаимодействии этих рецепторов с лигандами происходит активация сигнальных путей клетки, секреция эффекторных молекул, таких, как цитокины, противомикробные пептиды и др., изменение экспрессии других рецепторов и далее развитие адаптивного иммунного ответа [Ковальчук Л.В. и др., 2005]. Открытие PRR не только позволило по-новому взглянуть на фундаментальные аспекты развития хронических воспалительных заболеваний, но и создало основу для разработки дополнительных диагностических критериев этих патологических состояний [Чередеев А.Н. и др., 1999]. В последние годы накапливается все больше сведений, свидетельствующих о том, что снижение экспрессии и функции PRR в силу мутаций/полиморфизмов или эпигенетических нарушений регуляции PRR, лежит в основе развития иммунодефицитных состояний, которые проявляются инфекционно-воспалительными заболеваниями. В то же время избыточная экспрессия и активация PRR, как правило, приводит к хроническим аутовоспалительным, аутоиммунным и атопическим заболеваниям с подключением адаптивного иммунитета и нарастающей агрессией против собственных клеток и тканей [Хаитов Р.М. и др., 2007; Abreu M. et al., 2002].


Несмотря на то, что к сегодняшнему дню опубликованы многочисленные исследования, посвященные системе PRR клетки, остаются малоизученными важные вопросы, в частности, касающиеся функционирования системы PRR при воздействии на организм неблагоприятных факторов космического полета.

Цель работы

Комплексное изучение ответа клеточного звена врожденного иммунитета у здорового человека при воздействии на организм факторов космического полета и их наземном моделировании.

Задачи исследования

1. Исследовать влияние условий длительных космических полётов на систему PRR врожденного иммунитета космонавтов.

2. Оценить характер изменений экспрессии PRR врожденного иммунитета человека при моделировании некоторых эффектов микрогравитации в 5-суточной “сухой” иммерсии без применения средств профилактики.

3. Изучить процесс адаптации PRR врожденного иммунитета человека к условиям длительной изоляции в гермообъекте с искусственной средой обитания.

4. Исследовать фенотипические свойства антигенпрезентирующих клеток (дендритных клеток) у добровольцев-испытателей, находившихся в условиях длительной изоляции в гермообъекте с искусственной средой обитания.

Научная новизна работы

В проведенных исследованиях впервые был использован комплексный подход к оценке клеточных факторов естественной резистентности, который включал определение фенотипических и функциональных характеристик системы PRR, при воздействии на организм здорового человека факторов космического полета.

Впервые установлено, что после завершения длительных космических полетов изменение характера ответа, опосредуемого сигнальными образраспознающими рецепторами - TLR, определяется несколькими компонентами: увеличением сывороточного уровня эндогенного лиганда TLR - белка теплового шока HSP70; повышением экспрессии TLR2, TLR4 и TLR6 на моноцитах и гранулоцитах периферической крови; снижением индуцированного экзогенным лигандом TLR4 – ЛПС синтеза эффекторных молекул - цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-α и ИЛ-10. функциональных резервов.


Впервые показано, что длительное пребывание здорового человека в условиях изоляции в гермообъекте с искусственной средой обитания приводит к снижению уровня в периферической крови клеточных факторов естественной резистентности, экспрессирующих Toll-подобные рецепторы, и угнетению синтеза эффекторных молекул.

Впервые показано, что при моделировании физиологических эффектов микрогравитации в наземном эксперименте с 5-ти суточной «сухой» иммерсией изменения системы PRR характеризовались значительной индивидуальной вариабельностью и разнонаправленностью, связанной с существенными различиями адаптационных возможностей системы врожденного иммунитета.


Практическая и научная значимость работы

Результаты исследования изменений рецепторного аппарата и функциональной активности клеток моноцитарного и гранулоцитарного ростков крови, происходящих под действием факторов космического полета, существенно расширили представление о месте и роли врожденного иммунитета в физиологических реакциях организма, направленных на поддержание иммунного гомеостаза в неблагоприятных условиях среды обитания.

Практическая значимость результатов работы, продемонстрировавших депрессию функционирования клеток, экспрессирующих сигнальные образраспознающие рецепторы, на фоне увеличения их количества в периферической крови космонавтов после завершения длительных космических полетов, заключается в обосновании необходимости комплексного подхода к оценке основных звеньев системы Toll-подобных рецепторов, включающей анализ лигандов TLR, определение экспрессии TLR и функциональной активности TLR. Этот подход может быть использован при мониторинге состояния системы врожденного иммунитета, а также при выработке стратегии профилактики и коррекции нарушений иммунореактивности при воздействии на организм неблагоприятных факторов окружающей среды.

Полученные в работе данные о том, что в периоде ранней адаптации к условиям моделируемой гипогравитации существенную роль в развитии реакции клеточных факторов врожденного иммунитета играют индивидуальные особенности реагирования, могут послужить основой для обоснования новой концепции иммунологического обследования при формировании экипажей сверх длительных космических экспедиций. В соответствии с этой концепцией иммунологический контроль наряду с традиционными методами должен включать и методы для оценки функциональных резервов системы врожденного иммунитета.


Положения, выносимые на защиту

Кратковременное пребывание в условиях моделируемой микрогравитации сопровождается изменениями экспрессии Toll-подобных рецепторов клеточными факторами естественной резистентности, отличающимися значительной индивидуальной вариабельностью и разнонаправленностью.

Длительная изоляция в гермообъекте с искусственной средой обитания приводит к снижению уровня клеточных факторов естественной резистентности в периферической крови, экспрессирующих Toll-подобные рецепторы, и синтеза ими эффекторных молекул.

После длительных космических полетов в системе PRR происходят многофакторные изменения, которые включают повышение сывороточного уровня эндогенного лиганда TLR - белка теплового шока HSP70; повышение экспрессии Toll-подобных рецепторов на клетках врожденного иммунитета при снижении их функциональной активности.

Апробация работы

Диссертация прошла апробацию на заседании секции Учёного совета ГНЦ РФ-ИМБП РАН “Космическая физиология и биология” (протокол №4 от 08 июля 2011 г.).

Основные результаты были доложены на VIII, IX, Х Конференциях молодых ученых, специалистов и студентов, посвященных дню космонавтики (Москва, 2009, 2010, 2011), ХХI Съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Калуга, 2010), 38 Assembly COSPAR (Bremen, 2010) .

Публикации

Результаты диссертации изложены в 10 публикациях в научных журналах и сборниках конференций, из них 3 - в ведущих российских рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ ”Поддержка ведущих научных школ НШ-3402-2008.4” по теме “Молекулярно-клеточные механизмы влияния факторов космического полёта” и программы Фундаментальных исследований ГНЦ РФ-ИМБП РАН.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 161 страницах, иллюстрирован 15 рисунками и 25 таблицами. Список литературы содержит 263 цитируемых источника, из которых 53 - отечественных и 210 - зарубежных.



СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Основные направления и объем проведенных исследований представлены в таблице.

Таблица. Объем и структура исследований

Направления исследований

Продолжительность, сутки

Количество обследованных

Количество

тестов

1. Длительные космические полеты на МКС

170 – 199

10

540

2. Модельные наземные эксперименты










2.1. Модельный эксперимент с «сухой» иммерсией

5

12

396

2.2. Модельные эксперименты с длительной изоляцией в гермообъеме

105

360

6

6

540

612

ИТОГО




34

2088

Исследования проводились в соответствии с программой, одобренной Комиссией ГНЦ РФ-ИМБП РАН по биомедицинской этике, и информированным согласием испытуемых.

Материалом для исследования являлась периферическая кровь космонавтов и испытателей-добровольцев, участвовавших в наземных модельных экспериментах. Взятие проб крови у космонавтов проводилось за 60 суток до старта и на 1-7-е сутки после приземления, у испытателей-добровольцев - в фоновом периоде, во время воздействия и после его завершения.


Исследованные параметры:


  1. Содержание лейкоцитов, моноцитов, гранулоцитов в периферической крови;

  2. Фенотип поверхностных рецепторов моноцитов и гранулоцитов периферической крови;

  3. Фагоцитарная активность моноцитов и гранулоцитов периферической крови ;

  4. Митогениндуцируемый синтез цитокинов иммунокомпетентными клетками периферической крови;

  5. Содержание белка теплового шока HSP70 в сыворотке крови;

  6. Фенотип дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови in vitro

Определение содержания лейкоцитов, а также абсолютного и относительного количества моноцитов и гранулоцитов в периферической крови проводили на автоматическом гематологическом анализаторе Celltac-lfa МЕК 6318K (Nihon Kohden, Япония).

Рецепторный аппарат моноцитов и гранулоцитов периферической крови исследовали мультипараметрическим методом иммунофлюоресцентного анализа с использованием панели моноклональных антител: TLR1, TLR2, TLR4 и TLR6 (Hycult biotechnology, Голландия), CD11b, CD14, CD16, CD18, CD24, CD36, CD54, CD206 (Вeckman Coulter, США). Исследование проводились на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickinson, США).

Оценку поглотительной активности фагоцитов периферической крови определяли с помощью проточной лазерной цитометрии с использованием системы PHAGOTEST (Becton Dickinson, США)

Способность моноцитов секретировать цитокины в системе in vitro изучали в 24-часовых клеточных культурах, стимулированных липополисахаридом Escherichia coli O127 (ЛПС; Sigma, США) в концентрации 1 мкг/мл. В надосадочных жидкостях измеряли содержание цитокинов - ИЛ-10, ИЛ-8, ИЛ-6, ИЛ-1β и ФНО-α, с использованием коммерческого набора Flow Cytomix (Bender MedSystems, Австрия) для определения цитокинов методом проточной цитометрии. Анализ содержания цитокинов в исследуемых образцах проводили на цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Концентрация каждого цитокина вычислялась с помощью программы FlowCytomix Pro и являлась функцией интенсивности флюоресценции.


Уровень HSP70 определяли в сыворотке крови обследуемых методом ИФА с использованием коммерческого набора «HSP70 high sensitivity EIA kit» (Enzo Life Sciences, Дания) на автоматическом анализаторе MINILYSER (Tecan, Австрия).

Дендритные клетки (ДК) получали путём поэтапного культивирования из моноцитов периферической крови [Ariizumi K. Et al., 2000, Banchereau J. et al., 2000; Fritz J. H. Et al., 2005]. Определение маркёров на поверхности дендритных клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии с использованием антител к CD14, CD83, CD85, CD86, CD123, HLA-DR и соответствующих изотипических контролей (Вeckman Coulter, США).

Статистическая обработка результатов.

Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0» для Microsoft Windows. Достоверность уровня различия сравниваемых величин оценивали, используя непараметрический метод Уилкоксона. Данные представлены в виде медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75).



следующая страница >>