shkolaput.ru 1 2 ... 4 5


На правах рукописи


ПЛЕТЕНЬ АНАТОЛИЙ ПЕТРОВИЧ


ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА: РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА, ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА И АГРЕГАЦИИ БЕЛКОВ


03.00.04-Биохимия


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук


Москва-2008

Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии

им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета

им. М.В.Ломоносова


Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Муронец Владимир Израилевич


Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ

Гильмиярова Фрида Насыровна

доктор биологических наук Гмошинский Иван Всеволодович

доктор биологических наук Калита Наталия Федоровна


Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук


Защита состоится «16» марта 2009 г. в 14 ч. на заседании Диссертационного совета Д.001.002.01 при ГУ НИИ питания РАМН (109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14).


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ питания РАМН.


Автореферат разослан «____»______________200___ г.


Ученый секретарь


Диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Коденцова В.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Открытия последних лет показали, что хорошо известные биомолекулы могут участвовать в происходящих в клетке и организме процессах, проявляя новые, необычные функции. Полифункциональность, казалось бы, хорошо исследованных молекул биополимеров заставляет иначе взглянуть на их роль и значение [Ishitani et al., 1998, Муронец и др., 1999, Наградова, 2003]. Ярким примером такого полифункционального белка является глицеральдегид–3–фосфатдегидрогеназа (ГАФД) (NAD – зависимая фосфорилирующая D-глицеральдегид–3–фосфатдегидрогеназа, КФ 1.2.1.12), которая стала основным объектом данной работы.


ГАФД катализирует один из ключевых этапов гликолиза: реакцию окислительного фосфорилирования глицеральдегид–3–фосфата в 1,3–дифосфоглицерат с образованием NADH и является одним из самых изучаемых на сегодняшний день ферментов гликолиза [Наградова, 2001, Chuang et al., 2005]. Это связано не только с важностью обеспечиваемой им гликолитической функции, но еще и с обнаруженными многочисленными негликолитическими свойствами фермента в клетке [Tatton, 2000, Tisdale 2001]. Содержание ГАФД в тканях составляет 10-20% от общего количества растворимых белков, что свидетельствует об очень важной ее роли в жизни клетки. Наиболее необычным свойством ГАФД является ее способность превращаться при окислении сульфгидрильных групп в ацилфосфатазу, то есть приобретать новую ферментативную активность [Allison, Connors, 1970, Schmalhausen, Muronetz, 1997]. Функциональное значение появления такой активности ГАФД в регуляции энергетического обмена до сих пор было мало изучено. Кроме того, недавно было обнаружено, что ГАФД участвует в слиянии клеточных мембран и клеточной адгезии, экспорте тРНК, репликации и репарации ДНК. Имеются многочисленные данные о том, что ГАФД вовлечена в развитие нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера и Паркинсона и др.) и вирусных инфекций, а также показано, что она играет важную роль в индукции апоптоза клетки [Sirover, 1999, Mazzola, Sirover, 2001]. Однако конкретные механизмы, объясняющие участие ГАФД во всех этих патологических процессах, до сих пор неизвестны. Было высказано несколько гипотез об участии ГАФД в регуляции важных для клетки процессов (в том числе, связанных с патологическими изменениями) [Schmalhausen, Muronetz, 1997, Arutyunova et, al., 2003, Polyakova et al., 2005, Hara et al., 2006], которые, однако, не получили пока достаточного экспериментального подтверждения в имеющейся научной литературе по данному вопросу.

Кроме того, учитывая важность ГАФД для функционирования клетки, особое значение приобретает разработка подходов, позволяющих избирательно воздействовать на ее свойства.


Цели и задачи исследования. Целью работы является определение характеристик и установление механизмов тех внутриклеточных процессов, в которых ГАФД участвует за счет проявления своих неканонических функций, несвязанных непосредственно с гликолитическим процессом.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Проверка гипотезы, согласно которой, появление ацилфосфатазной активности у частично окисленной перекисью водорода ГАФД, может приводить к разобщению окисления и фосфорилирования в гликолизе.

2. Проверка предположения, согласно которому изменение связывания окисленной ГАФД с нуклеиновыми кислотами является одним из механизмов вовлечения фермента в индукцию апоптоза, и изучение влияния изменения внутриклеточной локализации ГАФД при индукции апоптоза в клетках HeLa.

3. Изучение взаимодействия шаперонина с ненативными и неправильно свернутыми формами фермента (на примере ГАФД), а также влияния такого взаимодействия на шаперонин-зависимое сворачивание белков.

4. Разработка методов получения антител к различным формам ГАФД для создания высокоспецифических ингибиторов ферментов, функционирующих за счет белок-белковых взаимодействий.

Научная новизна работы. В настоящей работе была экспериментально подтверждена гипотеза о существовании разобщения окисления и фосфорилирования в гликолизе на стадии, катализируемой ГАФД и 3-фосфоглицераткиназой. Было доказано, что как в смеси ферментов гликолиза, так и в тканевых экстрактах окисление ГАФД приводит к ускорению гликолиза и, одновременно, к уменьшению синтеза ATP. Был установлен механизм обнаруженного явления. Оказалось, что мягкое окисление ГАФД перекисью водорода приводит к появлению у фермента ацилфосфатазной активности при сохранении дегидрогеназной. Это ведет к разобщению гликолиза, изменяя его энергетическую эффективность и скорость. Важнейшим результатом окисления ГАФД перекисью водорода является способность эффективно образовывать лактат при недостатке ADP как в смеси гликолитических ферментов, так и в цитоплазматической фракции мышц.


Были получены прямые доказательства предположения об изменении связывания окисленной ГАФД с нуклеиновыми кислотами как одного из механизмов вовлечения фермента в индукцию апоптоза и перераспределения фермента между внутриклеточными фракциями. Так было доказано, что окисление ГАФД увеличивает ее сродство к нуклеиновым кислотам, особенно в присутствии окисленного кофактора фермента - NAD. Впервые было показано, что такой модификацией является окисление цистеиновых остатков в активных центрах фермента. Эти данные впервые показывают важную роль модификации высоко реакционноспособных сульфгидрильных групп ГАФД в регуляции сродства фермента к нуклеиновым кислотам. Было впервые обнаружено, что при апоптозе, вызванном действием перекиси водорода, происходит перераспределение ненативных форм ГАФД между ядром и цитоплазмой.

Впервые было показано, что формы белков, неспособные в принципе свернуться в нативную конформацию, необратимо блокируют шаперонин, препятствуя тем самым правильному сворачиванию других полипептидных цепей. Так, было обнаружено, что инкубация шаперонина GroEL с мутантными O-R–димерами (или с ГАФДДТНБ) в растворе приводит к образованию стабильного комплекса. При этом связывание шаперонина с этими формами ГАФД блокирует GroEL-зависимый рефолдинг термостабильной ГАФД B.st.. Кроме того, впервые было обнаружено, что присутствие окисленных форм ГАФД также блокирует шаперон-зависимую стадию ренатурации.

Был предложен метод получения антител против неактивных форм ферментов, которые были способны вызывать инактивацию нативного фермента за счет индукции конформационных перестроек. Было доказано, что в определенных условиях инактивируются не только те субъединицы фермента, которые взаимодействуют с антителом, но и соседние (благодаря передаче белок-белковых взаимодействий между отдельными субъединицами). Этот подход открывает новые возможности создания специфических ингибиторов ферментов на основе антител, вызывающих конформационные перестройки в белках за счет неполного соответствия эпитопов и активных центров антител.


Практическое значение работы
. На основании исследованных механизмов вовлечения ГАФД в регуляцию жизнедеятельности клетки в норме и патологии показано, что этот фермент является важным объектом для действия лекарственных препаратов. Прежде всего, возникает обоснованная возможность ускорять эффективность энергетического обмена путем ингибирования дегидрогеназной активности ГАФД мягкими окислителями. В этом случае окисленная ГАФД проявляет ацилфосфатазную активность, что приводит к разобщению окисления и фосфорилирования в гликолизе. В результате скорость гликолиза увеличивается, а снижение его эффективности (уменьшение образования АТР) компенсируется за счет окислительного фосфорилирования в митохондриях. Таким образом, нами предлагается новый способ воздействия на энергетический обмен клеток.

Обнаруженное нами влияние окисления ГАФД на эффективность ее связывания с нуклеиновыми кислотами и транслокацию в ядро позволяет, с одной стороны, предложить новые пути регуляции апоптоза, а с другой, разработать новые методы ранней диагностики патологических изменений в клетках и тканях на основе транслокации ГАФД из цитоплазмы в ядро.

На примере взаимодействия окисленной и модифицированной ГАФД с шаперонином показана возможная роль этого процесса в развитии нейродегенеративных заболеваний амилоидной природы. Правильный подбор лекарственных препаратов и продуктов питания, предупреждение воздействия ядовитых соединений, модифицирующих сульфгидрильные группы ГАФД, регулирование процесса окислительного стресса, профилактическое введение антиоксидантов должно препятствовать появлению поврежденных белков и исключать их блокирующее воздействие на шаперонин. На основании этих наблюдений могут быть предложены новые способы профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний (прежде всего профилактическое применение антиоксидантов).

Предложен принципиально новый подход для отбора антител, способных вызывать развивающуюся во времени инактивацию нативных форм ферментов. На основе этого метода могут быть получены новые типы ингибиторов ферментов, действие которых заключается в индукции конформационных перестроек, трансформирующих нативную конформацию белка в неактивную.


Апробация работы. Результаты работы были доложены на совместных заседаниях отделов биокинетики и биохимии животной клетки НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, а также на перечисленных ниже Всероссийских и международных конференциях: III съезд Биохимического общества РАН (Санкт-Петербург, 2002), Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003), Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Kiev, 2003), I Международная конференция “Химия, структура и функция биомолекул» (Минск, 2004), Международная юбилейная конференция, посвященная 70-летию В.П.Скулачева «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005), International conference «Fundamentals and Application» dedicated to 250th anniversary of Moscow State University (St.Petersburg-Kizhiy-Valaam, 2005), International alumni seminar on “Biotechnology and Health” (Erevan, 2005, 2008), II Международная конференция “Химия, структура и функция биомолекул» (Минск, 2006), VI симпозиум «Химия протеолитических ферментов», посвященного памяти В.К.Антонова (Москва, 2007), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Научно-практической конференции «Пищевая и морская биотехнология. Проблемы и перспективы» (Светлогорск, 2008).

По материалам диссертации опубликовано 35 печатных работ. Опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ – 9 публикаций, другие издания - 8 публикаций, материалы научных конференций - 18 публикаций.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (429 ссылок). Объем работы составляет 375 страниц, содержит 60 рисунков и 6 таблиц.



следующая страница >>